Biología Molecular Tercer Semestre Diabetes Mellitus
viernes, 8 de julio de 2016
EJEMPLOS DE TERAPIA GÉNICA EN LA DIABETES
Los pacientes con diabetes tipo 2 presentan ventajas respecto a la terapia génica. en los diabéticos tipo 2 no existe la destrucción autoinmune que podría destruir las células beta trasplantadas, como en el caso de la diabetes tipo 1. por otro lado, en contraste con la diabetes tipo 1, los individuos con diabetes tipo 2 tienen algunas reservas de insulina, cosa que aumenta las posibilidades técnicas de la terapia génica en este tipo de pacientes. una buena opción seria el trasplante de células beta maduras para sustituir las células no funcionales y así dar un optimo tratamiento a la enfermedad.
En la actualidad existen terapias para los 2 tipos de diabetes que resultan insatisfactorias porque no ofrecen una cura de la enfermedad, y en la mayoría de los casos no podrán evitar la aparición de las complicaciones secundarias asociadas a ella.
Una de ellas es el transplante de islotes pancreáticos que ha sido sin duda una esperanzadora estrategia para restaurar la masa de célula funcional en los pacientes diabéticos y poder así conseguir la normoglicemia; no obstante, presentan limitaciones, como el rechazo del injerto y el número de páncreas necesarios para la obtención de una cantidad óptima de islotes (al menos 2 donantes/pacientes).
Esto demuestra la necesidad de identificar nuevas terapias genéticas como, por ejemplo, la obtención de células productoras de insulina a partir de células pluripotentes. La viabilidad de esta nueva estrategia celular depende principalmente de 3 importantes pre requisitos:
Identificación de células pluripotenciales o unas células progenitoras pancreáticas que tengan la capacidad de auto replicarse y de generar células diferenciadas.
Identificación de las señales proliferativas que permiten expandir, de una manera específica, estos progenitores pancreáticos.
Identificación de señales instructivas que induzcan la diferenciación de estas células pluripotenciales o progenitoras en células funcionales que secreten la insulina correctamente procesada, de una manera pulsátil, en respuesta a concentraciones fisiológicas de glucosa.
Básicamente han sido utilizadas 2 estrategias de selección para células con capacidad de diferenciación beta celular, que son las siguientes:
Estrategia de Trapping: Las stem cells son transfectadas con una construcción que lleva un gen de resistencia a un antibiótico (neomicina) el cual está bajo el control del gen de la insulina. De esta manera, se seleccionan las células que al diferenciarse activarán únicamente dicho promotor; posteriormente, se añade a la construcción un marcador no tóxico, pero fácilmente perceptible: la proteína fluorescente del verde (GFP), de manera que las células expresan insulina y proteína verde, lo que permite una selección más fina de estas.
De ese modo, se estableció la línea celular IB/3x-99 derivada directamente de un cultivo de células ES de ratón, las cuales tienen la capacidad de formar los agregados de las células que secretaron la insulina de una manera dependiente de la glucosa.
Los agregados celulares fueron implantados en el bazo de ratones. La mayoría de los animales presentaron un control de la glucosa de la sangre.
Marcadores selectivos de células madre pancreáticas: La nestina es una proteína del filamento que se ha identificado por ser un marcador de células stem del sistema nervioso central. Por existir muchas similitudes entre ellas y las del páncreas, Lumelsky propuso a la nestina como un marcador específico de célula stem endocrina.
Se ha descrito que en el páncreas existe un proceso de neogénesis, es decir, de formación exnovo de islotes pancreáticos, que aumenta en diferentes situaciones, tanto en humanos como en modelos animales.
Aunque los experimentos han demostrado que en el páncreas existe un proceso regenerativo tanto intra como extra islote, la detección y caracterización de las stem cells pancreáticas está resultando un trabajo difícil.
La falta de unos marcadores claros, así como de ensayos fiables, ha obstaculizado esta difícil tarea. No obstante, sabemos que nuevas células se generan durante la vida adulta y que, en parte, provienen de células que se encuentran en el ducto pancreático.
La posibilidad de una expansión y diferenciación de estas células permite abrir la esperanza de obtener un número suficiente de células que ayuden al desarrollo de la terapia celular. Aún más apasionante es la posibilidad de que a partir de una pequeña muestra de tejido del paciente se pueda aislar y obtener in vitro nuevos islotes que podrían ser transplantados al propio paciente y evitar, de esta manera, problemas de rechazo.
La insulina que se administra a los diabéticos se obtenía de vacas y cerdos, con un efecto muy similar al producido a la variante humana, pero con numerosos problemas de tipo alérgico derivados de las impurezas con las que se obtenía.
INSULINA RECOMBINANTE
Obtencion
Utilizando las bacterias Escherichia colicomo factorías en miniatura para producir de forma separada las cadenas A y B de la insulina humana, introduciendo para ello los genes que las codifican en las bacterias mediante un vector (pBR322). Posteriormente se llevaba a cabo la purificación, plegamiento y unión in vitro de las cadenas, mediante la oxidación de las cisteínas para formar los puentes disulfuro de la proteína activa.
Resultado
El resultado fue una insulina humana (denominada comercialmenteHumulin), más barata de producir, potente y segura, ya que no mostraba los problemas que producían las homólogas animales, fue la primera proteína recombinante aprobada como medicamento. Hoy en día, prácticamente todos los diabéticos son tratados con algún tipo de insulina recombinante, pues se han conseguido numerosos análogos con diferentes cualidades.
Insulina recombinante, como tratamiento de la Diabetes Mellitus
En la actualidad, la vida de millones de diabéticos en el mundo depende de la insulina humana recombinante, una hormona fabricada mediante técnicas de ingeniería genética. Para el tratamiento de diabéticos insulino-dependientes, se produce la hormona utilizando vectores, que por lo general son bacterias; introduciéndoles fragmentos de ADN que codifican para esta cadena polipeptídica. A estos microorganismos se los han llamado "organismos genéticamente modificados” La "insulina recombinante" se ha aplicado en pacientes humados desde 1982, frente a los graves problemas que presentaban aquellos que aceptaban insulina de cerdos y vacas a causa del rechazo inmunológico de los pacientes.
Ejemplo de ADN recombinante en la Naturaleza
Es una célula de ADNartificial integrada de manera deliberada in vitro por la desunión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que normalmente no se encuentran juntos.Estas técnicas se emplean para la síntesis de proteínas en gran escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una proteína humana y lograr una superproducción, como en el caso de la insulina humana, que es elaborada por bacterias en grandes recipientes de cultivo, denominados biorreactores. Se aisló y se cortó el gen productor de la insulina humana del resto de ADN humano. Se insertó dicho gen en la bacteria Escherichia coli.Se potenció la multiplicación de las E. coli transgénicas que producían insulina en cultivos bacterianos para obtener un gran número de ellas.
Los Microarrays de ADN han dado a los investigadores médicos y científicos una poderosa herramienta para estudiar los mecanismos de las enfermedades complejas, como la obesidad y la diabetes tipo 2 (DT2). Perfiles de expresión génica son la principal aplicación de microarrays de ADN hasta ahora.
- La grasa subcutánea, grasa visceral, adipocitos y preadipocitos, músculo, hígado, páncreas y núcleos específicos en el hipotálamo en condiciones normales y de enfermedad se utilizan en el tratamiento del perfil de expresión de genes en la obesidad y T2D. - Secuenciacion automática de ADN - Analisis Automático de Fragmentos de ADN (PCR, Microrray, AFLP) - Análisis de PCR cuantitativo en tiempo real, que incluye expresion de genes, genotipificacion y analisis de fisión - Análisis de ADN y ARN
Al prepararnos como medicos de atencion primaria, el tener un tipo de tamizaje de este tipo para diagnóstico nos favoreceria y ayudaria mucho en lugares donde no exista equipos sofisticados para este tipo de pruebas:
El tamizaje se efectuó durante el año 2000, en la población adulta con al menos un factor de riesgo asociado, en 6 Equipos Básicos de Atención Integral en Salud (EBAlS), del Área de Salud 3 de Desamparados. Este se incorporó en el quehacer diario del EBAIS, sin alterar su programación. Se utilizaron cuatro estrategias para la realización del tamizaje: la oportunista, la selectiva, las programadas a grupos cautivos u organizacionales, y las jornadas de atención comunal o nacional.
La estrategia selectiva fue desarrollada por medio del apoyo de la Universidad de Costa Rica, buscanda las familias en riesgo (con un diabético en el hogar) y citando a los familiares directos del diabético al EBAIS, para hacerles la prueba de tamizaje por micrométodo con glucómetro. Si el resultado del micrométodo era sugestivo de DM2, se enviaba una glicemia por laboratorio. Se visitó a un 10% de las familias riesgo. La parte fundamental de búsqueda por tamizaje con micrométodo en la ronda domiciliar por el ATAPS, no se pudo realizar por no disponer de glucómetros. Aun así, a los PRDM se les recomendó hacerse una glicemia consultando en el EBAIS, pero de manera voluntaria, sin sistematización. Como iniciativa propia, en 2 EBAIS, si la persona reunía la condición de PRDM, se entregaron boletas de laboratorio para examen de glicemia en el domicilio durante la ronda domiciliar por el ATAP.
¿A quién se tamizó?
Se recomendó seguir los criterios de la Asociación Americana de Diabetes del año 2000 con una modificación: se eliminó la variable etnia hispana como factor de riesgo, al suponer que la mayoría de la población costarricense posee las características que definen esta variable.
Muchas modificaciones epigenéticas parecen estar influidas por factores ambientales, como el estrés, la dieta o el ejercicio físico, y otros relacionados con la obesidad, como la hiperglucemia, el estrés oxidativo, la hipoxia o la inflamación, modulan los cambios epigenéticos y contribuyen a su plasticidad a lo largo de la vida,o a la vez otros factores originados por la actividad humana, como algunos metales pesados, pesticidas y químicos ambientales, también parecen actuar a través de procesos epigenéticos. Muchos estudios recientes muestran que las dietas ricas en grasa y azúcar, así como la obesidad, se asocian con cambios en los patrones de metilación del ADN, que afecta a la región promotora de distintos genes implicados en la homeostasis energética en hígado, como la ácido graso sintasa(FASN)yNDUFB6. La diabetes tipo 2 se desarrolla debido a una respuesta inadecuada de las células β pancreáticas y del tejido adiposo frente a un exceso crónico de sustratos energéticos, lo que se traduce en un almacenamiento ectópico de grasa, resistencia a la insulina, diversos mecanismos epigenéticos como la metilación de los gene PPARGC1AyHNF4A pueden estar implicados en la disfunción de las células β y en la patogénesis de la diabetes.
BIBLIOGRAFÍA:
Fermín I. Milagro Y. y J. Alfredo Martínez H. Epigenética en obesidad y diabetes tipo 2: papel de la nutrición, limitaciones y futuras aplicaciones [Internet].2004 [citado 31 Octubre 2015];49(1):23-26.Disponible en:
